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Interféron leucocytaire humain: indications, mode d'emploi

Dans cet article, nous allons parler de l’un des médicaments antiviraux et immunostimulants efficaces. Il s'agira d'un interféron leucocytaire humain. Examinons les propriétés du médicament, ses indications, son mode d'emploi, etc.

Caractéristiques du médicament

L'interféron leucocytaire humain (nom international - interféron alpha) est disponible sous deux formes: une solution pour utilisation par inhalation et par voie intranasale et une poudre lyophilisée sèche (parfois sous forme de comprimés). La forme liquide a une couleur allant du incolore au rose pâle, sèche - du blanc au rosâtre.

L'interféron leucocytaire humain (Interferon leucocytic human) est un complexe de protéines synthétisées par les leucocytes du sang de donneur sous l'influence du virus inducteur d'interféron. Ils sont nettoyés par ultra-et microfiltration.

Analogues de ce médicament immunomodulateur:

L'outil peut être utilisé en association avec d'autres médicaments. Le médicament est délivré sans ordonnance du médecin et est valable 2 ans à compter de la date de fabrication. Conservez-le dans un endroit sombre et frais (2 à 8 degrés au-dessus de zéro). Tenir hors de la portée des enfants!

Les prix moyens de l’interféron leucocytaire humain sont relativement bas. Ainsi, dans la plupart des pharmacies, un paquet contenant 10 ampoules coûte entre 80 et 120 roubles.

La composition du médicament

1 ml d’interféron leucocytaire humain liquide contient:

  • Interféron Alfa - 1000 UI.
  • Chlorure de sodium - 0,09 mg.
  • Dihydrogénophosphate de sodium dihydraté - 0,06 mg.
  • Hydrogénophosphate de sodium dodécahydraté - 0,003 mg.
  • L'eau distillée pour injection est d'environ 1 ml.

Propriétés pharmacologiques

Ce médicament immunomodulateur appartient au groupe pharmacologique des cytokines. Ses propriétés sont les suivantes:

  • Immunostimulation - renforce la réponse immunitaire.
  • Immunomodulation - normalise le statut immunitaire.
  • Effets antibactériens - lutte contre différents types d’infections mixtes.
  • Action antivirale - aide l'organisme à résister aux maladies telles que l'herpès, la grippe, les maladies adénovirales.
  • Anti-inflammatoire, effet antitumoral.

Produit sec et liquide non toxique, stérile et inoffensif lorsqu’il est administré par les voies respiratoires. Ne pas utiliser de poudre pour injection.

Indications d'utilisation

L'interféron leucocytaire humain est utilisé à la fois pour la prévention des infections virales aiguës et pour le traitement des formes précoces de la maladie avec les symptômes initiaux.

Les indications peuvent être divisées en trois groupes principaux:

  • Utilisation intranasale: mesures préventives et traitement du SRAS, de la grippe.
  • Utilisation parentérale: verrues génitales, hépatites B et C, lymphome non hodgkinien, mélanome malin, myélome multiple, carcinome rénal, sarcome de Kaposi chez les personnes atteintes du SIDA (qui n'ont pas d'infections aiguës à ce moment-là), leucémie à tricholeucocytes, myosose fongique.
  • Utilisation rectale: traitement de l'hépatite virale chronique et aiguë.

En outre, le médicament sera efficace dans:

  • leucémie myéloïde chronique;
  • thrombocytose primaire et secondaire;
  • le stade de transition de la leucémie granulocytaire chronique, la myélofibrose;
  • réticulosarcome;
  • sclérose en plaques.

Contre-indications

Les instructions d’utilisation de l’interféron leucocytaire humain indiquent les contre-indications suivantes à l’utilisation du médicament:

  • L'épilepsie.
  • Violation des fonctions du système nerveux central.
  • Violation des reins et du foie, système hématopoïétique.
  • Maladie cardiaque organique.
  • Hépatite chronique chez les personnes dont le traitement récent consistait en immunosuppresseurs.
  • Maladies de la glande thyroïde.
  • Hépatite chronique.
  • Cirrhose du foie avec signes d'insuffisance hépatique.
  • Grossesse et allaitement.
  • Allergie.
  • Sensibilité individuelle accrue pour le composant actif - l'interféron alpha, ainsi que pour tous les médicaments d'origine protéique, pour la viande et les œufs de poulet.

La drogue est dangereux à prendre dans les cas suivants:

  • Durée de vie expirée.
  • L'intégrité de l'emballage a été compromise.
  • Il n'y a pas de marquage sur l'emballage.

Posologie et administration

Instructions pour l'utilisation d'interféron leucocytaire humain prescrit:

  • Pour les enfants de moins de 3 ans, administrer le médicament uniquement par voie intranasale (pulvérisation, instillation).
  • Enfants à partir de 3 ans, l'inhalation est également autorisée pour les adultes.

Application intranasale. Un flacon de médicament s'ouvre immédiatement avant l'utilisation. Ensuite, on y ajoute de l'eau distillée bouillie ou stérile, jusqu'à concurrence de 2 ml par capsule. Le produit est doucement agité jusqu'à dissolution complète.

Le médicament est instillé dans le nez avec une seringue sans aiguille ni pipette médicale. Une autre méthode est la pulvérisation: vous pouvez utiliser un pulvérisateur tiers ou celui fourni avec la préparation. La buse est placée sur la seringue sans aiguille, puis approchée du passage nasal ou y pénétrant sur environ 0,5 cm.La pulvérisation s'effectue en appuyant sur le piston de la seringue. Le patient doit s'asseoir la tête haute.

  • Prévention: s'applique tout au long du risque d'infection. Instiller - 5 gouttes, pulvériser - 0,25 ml dans chaque passage nasal. La manipulation par jour est effectuée jusqu'à 2 fois avec un intervalle d'au moins 6 heures.
  • Traitement: aux premiers signes de la maladie. 5 gouttes ou 0,25 mg dans chaque narine. La procédure est répétée jusqu'à 5 fois par jour avec un intervalle de 1 à 2 heures.

L'interféron leucocytaire humain est administré à des enfants et à des adultes à la même dose.

L'inhalation. L'utilisation par inhalation est considérée comme plus efficace. Pour cela, vous devez acheter un inhalateur de n’importe quel fabricant. Pour une procédure nécessite le contenu de trois capsules, qui doivent être dissous dans 10 ml d'eau, chauffée à 37 degrés. De cette façon, le médicament est administré par la bouche et par le nez deux fois par jour pendant 2-3 jours.

L'injection de l'agent est interdite!

Effets secondaires

En utilisant ce médicament immunomodulateur, les effets secondaires suivants sont possibles:

  • Au niveau du tractus gastro-intestinal: modification du goût, bouche sèche, flatulences, constipation, vomissements, diarrhée, nausée, perte d'appétit. Dans de rares cas - une violation du foie.
  • Du côté du système nerveux central: ataxie, somnolence ou troubles du sommeil, troubles de la conscience, dépression, nervosité.
  • Du côté du cœur et des vaisseaux sanguins: arythmie, hypotension artérielle.
  • Effets dermatologiques: éruption cutanée, légère alopécie, érythème, peau sèche.
  • Syndrome pseudo-grippal: faiblesse, fièvre, myalgie, mal de tête.
  • Autres: granulocytopénie, sensation de faiblesse, léthargie, perte de poids, troubles visuels, vertiges.

Instructions spéciales

Veillez à appliquer l'outil lorsque:

  • Infarctus du myocarde récemment subi.
  • Myélodépression, modification de la coagulation sanguine.
  • Patients âgés à qui on a diagnostiqué des effets secondaires du système nerveux central lors de l’utilisation de doses élevées du médicament. Cela peut même valoir la peine d'interrompre le traitement.
  • Les patients atteints d'hépatite C avant le traitement devraient être soumis à un test de dépistage du taux de TSH dans le sang. Le traitement par interféron ne peut être instauré qu’avec des indicateurs normaux. Dans d'autres cas, violation possible de la fonction thyroïdienne.
  • Combiné avec des analgésiques opioïdes, des hypnotiques et des sédatifs.

L'interféron humain leucocytaire est un agent anti-infectieux immunostimulant efficace. Il présente un certain nombre de fonctionnalités d'utilisation et de contre-indications. Il est donc nécessaire de se familiariser avec les instructions avant de l'utiliser.

Les interférons. Obtention de l'interféron

Thème: Interférons. Obtention de l'interféron.

Les interférons ont été découverts en 1957 à l'Institut national de recherche médicale de Londres en tant que facteurs de résistance à l'infection virale. Il a été constaté que les cellules animales exposées au virus libéraient dans l'environnement des cellules saines un facteur capable de conférer une résistance à l'infection virale: il semblait empêcher (interférer) la multiplication des virus dans la cellule et était appelé interféron en raison de cette capacité. Il existe trois types d'interféron:

α, β, attribuable à la première classe, γ-interféron, attribuable à la deuxième classe.

L'interféron-α, produit par les leucocytes, a un effet principalement antiviral, anti-prolifératif et anti-tumoral.

L'interféron-β, formé par les fibroblastes, a un effet principalement antitumoral et antiviral.

L'interféron -γ - est produit par les lymphocytes T et les tueurs naturels (cellules NΚ) et est appelé lymphocytaire et immunitaire. Il a un effet antiviral faible principalement immunomodulateur.

Dans le monde des affaires, comme dans le monde, il est destiné à augmenter le taux de croissance de la cellule et à augmenter la densité des lymphocytes. multiplication du virus dans la cellule infectée, ce qui provoque sa lyse. Le même mécanisme d'action anti-proliférante anti-proliférative des interférons.

L'interféron-γ est une lymphokine immunomodulatrice multifonctionnelle qui affecte la croissance et la différenciation de cellules de différents types. Il active les macrophages au stade du transfert des informations antigéniques aux lymphocytes, augmente leur activité antimicrobienne et antitumorale, en produisant de l'IL-1. IF-γ active les cellules tueuses naturelles, les lymphocytes cytotoxiques, qui inhibent la croissance des tumeurs.

Les interférons-α sont des protéines et les interférons β et γ sont des glycoprotéines, ce sont des protéines globulaires typiques. Deux liaisons disulfure ont été trouvées dans les α-interférons. Les interférons sont des protéines de faible poids moléculaire provenant de 146 à 166 résidus d’acides aminés, spécifiques à une espèce, c.-à-d. l'interféron humain est biologiquement actif dans le corps humain, l'interféron de souris ne se trouvant que chez la souris.

Les interférons les plus étudiés sont les interférons α; le nombre de gènes les codant est d'environ 20, ils sont situés sur le chromosome 9. En ce qui concerne l'interféron β - une seule protéine a été isolée, correspondant à l'interféron β humain - l'interféron β 1 - presque toute l'activité antivirale y correspond. Il est possible que le génome contienne un certain nombre de gènes codant pour divers interférons β. Les gènes de β - interféron sont situés sur le chromosome 9. L'interféron-γ est représenté par une seule protéine individuelle, codée par un seul gène situé sur le 12ème chromosome.

Obtention de l'interféron. Les interférons constituent l'un des moyens les plus efficaces de traitement des infections virales, mais ils sont spécifiques à une espèce et ne peuvent être obtenus qu'à partir de cellules humaines. La technologie d’isolement et de purification de l’interféron est inefficace, principalement en raison du rendement extrêmement faible du produit final (1 µg d’interféron seulement peut être extrait de 1 litre de sang, soit environ une dose par injection).

Au stade actuel, la méthode la plus prometteuse est la biosynthèse d'interférons à l'aide de microorganismes modifiés génétiquement. L'ADNc obtenu par transcription inverse a été cloné dans E. coli. Le gène d'interféron a été inséré dans l'ADN du vecteur et des éléments régulateurs bactériens y ont été ajoutés, ce qui programme sa transcription et sa traduction dans une cellule bactérienne. Tout d'abord, les interférons dans la cellule sont synthétisés sous forme de précurseurs contenant un peptide signal au niveau de l'extrémité N-terminale de la chaîne polypeptidique, qui est ensuite clivé et en conséquence, un interféron mature est formé, qui possède une activité biologique complète. Les bactéries ne contiennent pas d'enzymes capables de cliver le peptide signal pour former une protéine mature. Par conséquent, afin que les bactéries puissent synthétiser de l'interféron mature, seule la partie du gène qui le code doit être introduite dans le plasmide et la partie du gène codant pour le peptide signal doit être supprimée. Cette procédure a été effectuée comme suit. Le gène de l'interféron contient trois sites de clivage des enzymes de restriction Sau 3A1, dont l'un est situé près de la partie signal. Le clivage incomplet du gène par cette enzyme vous permet de sélectionner un fragment de gène contenant la séquence nucléotidique codant pour un interféron mature, mais sans la première cystéine. Le triplet ATG codant pour la cystéine est clivé par l'enzyme en même temps que la partie signal. Pour restaurer la séquence polynucléotidique du gène complet, un petit fragment d’ADN contenant ce triplet et le triplet ATG qui le jouxte - le point d’initiation de la synthèse protéique - a été synthétisé par voie chimique. Ce fragment était attaché à une partie isolée du gène mature et, en conséquence, tout le gène de l'interféron mature a été récupéré. Le gène reconstruit a été introduit dans le plasmide de manière à ce que le promoteur de l'ADN, à l'origine de la synthèse de l'ARNm, soit apparu à côté de celui-ci. Des extraits d'E. Coli contenant un tel plasmide possédaient une activité antivirale. L'interféron synthétisé par la méthode du génie génétique a été isolé, purifié et ses propriétés physicochimiques se sont avérées être proches de celles de l'interféron obtenu à partir du sang de donneurs. Il a été possible d’obtenir des bactéries capables de synthétiser jusqu’à 5 mg d’interféron par litre de suspension bactérienne contenant environ 1011 cellules bactériennes, soit 5000 fois la quantité d’interféron pouvant être extraite à partir de 1l de sang de donneur.

Lors de l'utilisation de technologies de génie génétique dans différents laboratoires, des souches bactériennes produisant divers interférons ont été obtenues: types α, β et γ. L'absence d'utilisation d'E. Coli pour la production d'interférons bêta et γ est l'absence d'appareil de glycosylation des protéines eucaryotes dans les bactéries, ce qui conduit à la synthèse de molécules non glycolisées. Et bien que le rôle de la glycolisation ne soit pas clair et que les interférons β et γ non glycolisés retiennent presque complètement l'activité antivirale, cette caractéristique impose une approche prudente de l'utilisation de médicaments modifiés par génie génétique dans la pratique médicale.

Actuellement, des gènes d'interféron ont été clonés dans des cellules de levure et eucaryotes supérieures capables de glycosylation. En 1981, des cellules de Saccharomyces cerevisiae génétiquement modifiées ont été utilisées pour la première fois aux États-Unis pour la synthèse d'interféron de leucocytes humains. L'expression efficace résultante du gène LeIF et le remplacement de bactéries par des cellules de levure ont permis d'augmenter de 10 fois la production d'interféron.

Les interférons sont disponibles sous forme de médicaments sous forme de gouttes nasales, de pommades et de solutions injectables. Il existe des interférons naturels obtenus à partir de lymphocytes de sang de donneur et synthétisés artificiellement à l'aide de technologies de génie génétique (recombinant). Actuellement, des préparations commerciales sont produites en Russie et à l'étranger - leucocytes humains, lymphoblastiques (Velferon) et fibroblastiques (Feron), ainsi que des interférons obtenus par des méthodes de génie génétique: interféron α recombinant (Roferon, Realderon, etc.), β- l'interféron et le γ-interféron (gammaferon).

Méthode de préparation d'interféron immun humain

Utilisations: biotechnologie, industrie médicale. L’essence de l’invention: construire un plasmide recombinant pSV 69, comprenant un fragment d’un précurseur d’ADN codant pour l’interféron immun humain; transformer la lignée cellulaire de vecteur recombinant obtenue COS-7, sélectionner les cellules transformées qui sont cultivées dans des conditions assurant l’accumulation du produit cible et isoler la forme mature de l’interféron sans l’interféron Cys-Tyr-Cys N-terminal (interféron des-Cys-Tyr-Cys). 8 malade.

Dessins au brevet de la Fédération de Russie 2107728

L'invention concerne la technologie de l'ADN recombinant, des moyens et méthodes d'utilisation de cette technologie dans la divulgation de la séquence d'ADN et de sa séquence d'acides aminés déterminée pour l'interféron immun humain, de sa production, ainsi que des différents produits obtenus avec celle-ci et de leur utilisation.

Plus spécifiquement, la présente invention concerne l'isolement et l'identification de séquences d'ADN codant pour l'interféron immun humain, et la construction d'un vecteur d'expression recombinant contenant ces séquences d'ADN liées de manière opérationnelle à des séquences promotrices, et pour effectuer l'expression avec les vecteurs ainsi obtenus. Dans un autre aspect, la présente invention concerne des systèmes de culture hôtes, tels que divers microorganismes et cultures de cellules de vertébrés, transformés avec des vecteurs d'expression et visant ainsi à exprimer les séquences d'ADN mentionnées précédemment. Dans un autre aspect, la présente invention concerne des moyens et des procédés pour convertir les produits finaux d'une telle expression en nouveaux objets, tels que des compositions pharmaceutiques appropriées pour le traitement et la prophylaxie chez l'homme.

Dans des modes de réalisation préférés, la présente invention fournit des vecteurs d'expression spécifiques qui ont des séquences telles que l'interféron immun humain est produit et sécrété par les cellules hôtes sous une forme mature. De plus, la présente invention concerne divers procédés utilisés pour obtenir de telles séquences d'ADN, vecteurs d'expression, systèmes de culture hôtes et produits finaux et leurs dérivés, ainsi que des conditions spécifiques et apparentées.

La présente invention est partiellement dérivée de la découverte d'une séquence d'ADN et d'une séquence établie d'acides aminés codant pour un interféron immun humain. De plus, la présente invention fournit des informations sur la séquence des séquences des côtés 3 "et 5" du gène de l'interféron immun humain, ce qui facilite sa liaison in vitro à des vecteurs d'expression. En particulier, un segment d’ADN de 5 ", codant pour le polypeptide de signalisation endogène proposé, qui précède immédiatement la séquence d’acides aminés de l’interféron humain mature supposé, a été mis en place. à son tour, la possibilité de déterminer ses propriétés biochimiques et sa bioactivité.

Les publications et autres supports utilisés pour mettre en évidence les prémisses de l’invention, ainsi que dans certains cas pour mettre en évidence des détails supplémentaires concernant son utilisation, sont incorporés par référence, par souci de commodité, numérotés dans le texte suivant et situés de manière appropriée dans la liste de bibliographie ci-jointe.

Contexte de l'invention
A. Interféron humain immunitaire
Les interférons humains peuvent être classés en trois groupes en fonction des différentes antigénicité et propriétés biologiques et biochimiques.

Le premier groupe est une famille d'interférons leucocytaires (interféron, Le IF ou IFN-), qui sont généralement produits principalement par les cellules sanguines humaines correspondantes sous l'influence de virus. Ces interférons ont été obtenus par méthode microbiologique et leur activité biologique a été détectée (1, 2, 3). Leurs propriétés biologiques ont déterminé leur utilisation en clinique comme agents thérapeutiques dans le traitement des infections virales et des affections malignes (4).

Le second groupe contient de l'interféron fibroblastique humain (interféron, FIF ou IFN-), généralement produit par les fibroblastes sous l'action de virus, également obtenu par des méthodes microbiologiques, et s'est révélé présenter un large éventail d'activités biologiques (5). Les essais cliniques indiquent également sa valeur thérapeutique potentielle. Les interférons de leucocytes et de fibroblastes présentent une similitude très nette dans leurs propriétés biologiques, malgré le fait que le degré d'homologie au niveau des acides aminés est relativement faible. De plus, les deux groupes d'interférons contiennent de 165 à 166 acides aminés et sont des protéines stables aux acides.

L'interféron humain (interféron, IIF ou IFN-) humain, objet de la présente invention par opposition à - et - interféron, pH 2 est labile, il est obtenu principalement par induction mitogénique de lymphocytes et ses propriétés antigéniques sont complètement différentes. Jusqu'à récemment, l'interféron immun humain ne pouvait être obtenu qu'en très petites quantités, ce qui a naturellement rendu difficile sa caractérisation. Récemment, une purification beaucoup plus élevée, mais encore partielle, de l'interféron immun humain a été rapportée (6). Il a été rapporté que ce composé avait été obtenu à partir de cultures de lymphocytes stimulés par une combinaison de phytohémagglutinine et d'ester de phorbol et purifié à l'aide de séparations chromatographiques successives. À la suite de cette procédure, un produit d'un poids moléculaire de 58 000 a été obtenu.

L'immuno-interféron humain a été obtenu en très petites quantités de traduction d'ARNm en oscites montrant les caractéristiques de l'activité de l'interféron humain, et on espérait que l'ADNc d'interféron immunitaire pourrait être synthétisé et cloné (7).

La quantité d’interféron immunitaire obtenue jusqu’à présent est clairement insuffisante pour mener des expériences incontestables de caractérisation et de détermination des propriétés biologiques du composant purifié. Cependant, des études in vitro menées avec des médicaments non purifiés, ainsi que des expériences in vivo avec des préparations d'interféron de rat, ont permis de supposer que la fonction principale de l'interféron immunitaire pourrait être celle d'un agent immunorégulateur (8 et 9). L'interféron immunitaire a non seulement une activité antivirale et anti-cellulaire commune à tous les interférons humains, mais aussi un effet potentialisateur sur ces activités des - et des interférons (10). De plus, l'effet antiprolifératif de l'interféron α sur les cellules tumorales in vitro serait environ 10 à 100 fois supérieur à celui des autres classes d'interférons (8, 11, 12). Ce résultat, associé à son rôle immunorégulateur prononcé (8 et 9), suggère une capacité antitumorale beaucoup plus marquée pour l'IFN-que pour le FN et l'IFN-. En effet, dans des expériences in vivo sur souris et rats, les médicaments à l'IFN démontrent une supériorité marquée par rapport aux interférons stimulés contre le virus en termes d'activité antitumorale contre le sarcome ostéogène (13).

Avant la présente invention, toutes ces études devaient être effectuées sur des préparations substantiellement contaminées en raison de leur disponibilité extrêmement faible. Cependant, ils ont confirmé sans équivoque les fonctions biologiques très importantes de l'interféron immun. L'interféron immunitaire possède non seulement la principale activité antivirale, mais aussi probablement une forte activité immunorégulatrice et antitumorale, qui le définit clairement comme un objet clinique potentiellement prometteur.

Il était clair que l’utilisation de la technologie de l’ADN recombinant devrait être le moyen le plus efficace d’obtenir les grandes quantités nécessaires d’interféron immun humain. Indépendamment du fait que les substances ainsi obtenues incluent ou non la glycosylation, considérée comme une caractéristique du matériel naturel, dérivé de l’homme, elles montreront apparemment une bioactivité, ce qui déterminera leur utilisation clinique dans le traitement d’un grand nombre de maladies virales, de néoplasmes et de maladies l'immunité.

B. Technologie de l'ADN recombinant
La technologie de l'ADN recombinant a mûri.

Les biologistes moléculaires sont capables de recombiner assez facilement diverses séquences d'ADN, créant de nouveaux types d'ADN capables de produire des quantités significatives de produits protéiques exogènes dans des microbes transformés. Fondamentalement, des moyens et des procédés pour la liaison in vitro de différents fragments d'ADN à extrémités franches ou «collantes» ont été développés. Grâce à eux, des vecteurs d'expression potentiels sont obtenus qui conviennent à la transformation de microorganismes spécifiques, régulant ainsi la synthèse dirigée des produits exogènes souhaités. Cependant, pour des produits individuels, cette voie reste assez difficile et la science n’a pas encore atteint le stade où le succès peut être garanti.

Un plasmide, une boucle non chromosomique d’ADN double brin trouvée dans des bactéries et d’autres microbes, souvent sous la forme de copies multiples par cellule, reste un élément essentiel de la technologie de l’ADN recombinant. Les informations codées dans l'ADN plasmidique comprennent les informations nécessaires à la reproduction du plasmide dans les cellules filles (c'est-à-dire la source de réplication) et généralement une ou plusieurs caractéristiques de sélection phénotypiques, telles que la résistance aux antibiotiques des bactéries, permettant aux clones de cellules hôtes contenant plasmide, à reconnaître et de préférence sur un milieu sélectif. L'utilisation de plasmides réside dans le fait qu'ils peuvent cliver spécifiquement l'une ou l'autre endonucléase de restriction ou "enzyme de restriction", chacune reconnaissant différentes parties de l'ADN plasmidique. Ensuite, des gènes ou des fragments de gènes hétérologues peuvent être incorporés dans le plasmide en reliant les extrémités au site de clivage ou aux extrémités reconstruites adjacentes au site de clivage. Donc, obtenez des vecteurs d'expression dits réplicables. La recombinaison de l'ADN est effectuée à l'extérieur de la cellule. Toutefois, le vecteur d'expression réplicable recombinant résultant peut être introduit dans les cellules de manière connue sous le nom de transformation, produisant de grandes quantités de vecteurs recombinants résultant de la croissance du transformant. De plus, si le gène est orienté de manière appropriée vers la partie du plasmide qui contrôle la transcription et la traduction de l'ADN codant, le vecteur d'expression résultant peut être utilisé pour obtenir réellement la séquence polypeptidique codée par le gène inséré, c'est-à-dire. pour un processus appelé expression.

L'expression est initiée dans une région connue sous le nom de promoteur qui est reconnue et liée par l'ARN polymérase. Lors de la phase de transcription, l'expression de l'ADN est dérivée, ce qui l'ouvre comme une matrice chimique pour la synthèse initiée de l'ARN messager à partir de la séquence d'ADN. L'ARN informatif, à son tour, est traduit en un polypeptide avec une séquence d'acides aminés codée par l'ARNm. Chaque acide aminé est codé par un triplet de nucléotide ou "codon", qui constituent ensemble le "gène structural", c'est-à-dire la partie qui code pour la séquence d'acides aminés du produit polypeptidique exprimé. La traduction est initiée par un "début" - un signal (généralement ATG, qui dans l’ARN informatif résultant devient AUG). Les codons dits "stop" déterminent la fin de la diffusion et, en conséquence, la fixation des unités d'acides aminés suivantes. Le produit cible peut être obtenu en lysant la cellule hôte, si nécessaire, et en le séparant par des méthodes de purification appropriées des protéines restantes.

En pratique, l'utilisation de la technologie de l'ADN recombinant peut permettre l'expression de polypeptides complètement hétérologues (l'expression dite directe) ou, dans un autre mode de réalisation, de polypeptides hétérologues liés à une partie de la séquence d'acides aminés du polypeptide homologue. Dans ce dernier cas, le produit bioactif cible reste parfois inactif dans le polypeptide homologue-hétérologue fusionné jusqu'à ce qu'il soit clivé dans l'environnement extracellulaire (voir la publication de brevet britannique n ° 2007676A et American Scientist 68, 664 (1980).

C. Technologie de la culture cellulaire.

L'art de la culture cellulaire ou du tissu est bien développé pour étudier la génétique et la physiologie des cellules. Il existe des dispositifs et des procédés connus pour maintenir des lignées cellulaires permanentes obtenues par une série séquentielle de transferts à partir de cellules normales isomées. Pour une utilisation en recherche, ces lignées cellulaires sont maintenues sur des substrats solides dans un milieu liquide ou cultivées en suspension contenant des nutriments de soutien. Obtenir de plus grandes quantités de médicaments est réduit à des problèmes mécaniques. On trouvera une description plus détaillée des conditions préalables de l’invention dans Microbiology and Edition, Harpes and Row Reblishers, Inc., Hagerstown, Maryland (1973), notamment à la page 1122, ainsi que dans Scientific American 245, 66 et autres (1981), chacun étant inclus. ici comme référence.

La présente invention est basée sur la découverte que la technologie de l'ADN recombinant peut être utilisée avec succès pour obtenir un interféron immun humain, de préférence sous forme directe et en quantités suffisantes pour initier et effectuer des tests sur des animaux et dans des cliniques, ce qui est nécessaire avant d'entrer sur le marché. Ce produit convient à une utilisation sous toutes ses formes pour la prévention et le traitement des infections virales, des néoplasmes malins et des affections du système immunitaire inhibé ou défectueux. Ses variants incluent diverses formes oligomères, qui peuvent inclure une glycosylation. Ce produit est obtenu dans des microorganismes reconstruits génétiquement transformés ou dans des systèmes de culture cellulaire transformés.

Tel qu'utilisé ici, le terme "cellule transformante" désigne une cellule dans laquelle un ADN est inséré, ledit ADN étant le produit de la recombinaison d'ADN exogène, et la descendance de l'une quelconque de ces cellules qui retient l'ADN introduit de cette manière.

Ainsi, il est maintenant possible de produire et de sécréter de l’interféron immun humain plus efficacement qu’auparavant. L'un des facteurs essentiels de la présente invention dans son mode de réalisation le plus préféré est la réalisation de la possibilité de diriger génétiquement un microorganisme ou une culture cellulaire vers la production d'interféron immun humain en quantités suffisantes pour isoler les cellules hôtes sécrétées sous forme mature.

La présente invention inclut l'interféron immun humain humain ainsi obtenu, des moyens et des procédés pour sa préparation. En outre, la présente invention concerne des vecteurs d'expression d'ADN réplicables stockant les séquences de gènes codant pour l'interféron immun humain sous une forme accessible à l'expression.

La présente invention concerne également des souches de microorganismes ou des cultures cellulaires transformées avec les vecteurs d'expression décrits précédemment, ainsi que des cultures microbiennes ou cellulaires de telles souches transformées ou cultures capables de produire un interféron immun humain. Dans un autre aspect, la présente invention concerne divers procédés appropriés pour obtenir les séquences indiquées du gène d'interféron immun, des vecteurs d'expression d'ADN, des souches de microorganismes et des cultures cellulaires et leurs variants spécifiques. De plus, la présente invention concerne l'obtention de cultures de fermentation de ces microorganismes et de cultures de cellules.

La présente invention concerne également l'obtention d'un interféron immun humain en tant que produit d'expression directe d'une cellule hôte sécrétée sous une forme mature. Cette réalisation peut utiliser le gène codant pour la séquence d'un interféron immunitaire humain mature, plus un ADN se dirigeant vers 5 "codant pour un polypeptide signal. On pense que le polypeptide signal transporte la molécule vers la paroi cellulaire de l'organisme hôte, où il est clivé pendant le processus de sécrétion d'une personne mature. Cette option permet d’isoler et de purifier l’interféron immunitaire mature cible sans faire référence à l’inclusion d’une procédure conçue pour éliminer les impuretés de la protéine ou des cellules intracellulaires de l’hôte. Cing fragments.

Le terme «interféron immun humain mature» tel qu’utilisé dans le texte désigne une culture microbienne ou cellulaire d’un interféron immun humain ne contenant pas de peptide signal ni de séquence pré-peptidique qui accompagne nécessairement la traduction de l’ARNm de l’interféron immun humain.

Le premier interféron immun humain recombinant, obtenu conformément à la présente invention, contient de la méthionine en tant que premier acide aminé (résultant de l’inclusion du codon du signal de départ ATG avant le gène de structure) ou, si la méthionine est clivée de manière intra ou extracellulaire, elle est normale. le premier acide aminé est la cystéine. L'interféron humain humain mature peut également être obtenu sous forme de conjugué avec une protéine autre qu'un polypeptide de signalisation normal et un conjugué qui peut être spécifiquement clivé à l'intérieur ou à l'extérieur de la cellule (voir la publication de brevet britannique 2007676A). Et enfin, un interféron immunitaire humain mature peut être obtenu par expression directe sans qu'il soit nécessaire de couper tout polypeptide en excès étranger. Ceci est particulièrement important dans les cas où un hôte donné n'est pas capable d'éliminer ou d'éliminer suffisamment le peptide signal et où le vecteur d'expression est destiné à exprimer un interféron humain mature avec son peptide signal. L’interféron humain mature ainsi obtenu est isolé et purifié à un niveau répondant aux exigences nécessaires à l’utilisation dans le traitement des maladies virales, des néoplasmes malins et des pathologies à immunité supprimée ou insuffisante.

L'interféron humain a été obtenu comme suit.

1. Des tissus humains, par exemple des tissus de la rate humaine ou des lymphocytes du sang périphérique, ont été cultivés avec des mitogènes pour stimuler la production d'interféron immunitaire.

2. Un culot cellulaire provenant d'une telle culture cellulaire a été extrait en présence d'un inhibiteur de ribonucléase dans le but de produire un ARN cytoplasmique complet.

3. Sur la colonne oligo-dT, l'ARN informatif total (ARNm) a été isolé sous forme polyadénylée. La taille de cet ARN a été fractionnée en utilisant un gradient de densité de saccharose et une électrophorèse sur gel en présence d'acide urée.

4. L'ARN correspondant (de 12S à 18S) a été converti en l'ADN complémentaire simple brin correspondant (ADNm), à partir duquel l'ADNc double brin a été obtenu. Après l’allongement poly-dC, il est inclus dans le vecteur de sorte que le plasmide possède un ou plusieurs marqueurs phénotypiques.

5. Les vecteurs ainsi obtenus ont été utilisés pour transformer des cellules bactériennes afin d'obtenir une banque de colonies. L'ADNc marqué aux radio-isotopes, obtenu à partir d'ARN induit et non induit, isolé comme décrit précédemment, a été utilisé pour déterminer séparément les banques de colonies dupliquées. Ensuite, l'excès d'ADNc a été éliminé et les colonies ont été exposées à un film radiographique pour identifier les clones d'ADNc induits.

6. A partir des clones d'ADNc induits, l'ADN plasmidique correspondant a été isolé et une séquence de bases a été déterminée.

7. L'ADN séquencé a été préparé in vitro pour inclusion dans un vecteur d'expression approprié, utilisé pour transformer une cellule hôte appropriée, ce qui a permis à son tour de se développer en culture et d'exprimer l'interféron immunitaire humain cible.

8. Dans certains systèmes de cellules hôtes, étant incorporé dans un vecteur d'expression afin d'être exprimé avec le peptide signal, la forme mature d'interféron immun humain est sécrétée dans le milieu de culture cellulaire, ce qui facilite les méthodes d'isolement et de purification.

Description de modes de réalisation préférés de l'invention.

A. Système de culture cellulaire / vecteurs de culture cellulaire.

La reproduction de cellules de vertébrés en culture (culture tissulaire) est devenue une procédure courante ces dernières années (voir Académie de culture tissulaire Riess Kruse et Paterson, 1973). Dans ce cas, la lignée de fibroblastes de rein de singe COS-7 a été utilisée comme hôte pour la production d'interféron immun (25a). Cependant, les expériences décrites ici en détail peuvent être effectuées sur toute lignée cellulaire capable de répliquer et d'exprimer un vecteur compatible, par exemple les lignées cellulaires W138, BHK, 3T3, CHO, VERO et HeLa. De plus, il est nécessaire que le vecteur d'expression possède un site d'initiation de réplication et un promoteur situé devant le gène à exprimer, ainsi que les sites de liaison au ribosome nécessaires, les sites d'épissage d'ARN, les sites de polyadénylation et les terminateurs de transcription. Bien que ces éléments importants de la SV40 aient été utilisés ici, il convient de garder à l'esprit que l'invention, bien qu'elle soit décrite ici du point de vue de son mode de réalisation préféré, ne doit pas être considérée comme limitée à ces séquences. Par exemple, des sources de réplication d'autres vecteurs viraux (par exemple, Polyoma, Adeno, VSV, BPV, etc.) peuvent être utilisées, ainsi que des sources cellulaires de réplication de l'ADN pouvant fonctionner dans un état non intégré.

B. Expression en culture cellulaire de mammifère.

La stratégie de synthèse de l'interféron immunitaire en culture cellulaire de mammifère repose sur le développement d'un vecteur capable à la fois de réplication autonome et d'expression d'un gène étranger sous le contrôle d'un fragment de transcription hétérologue. La réplication de ce vecteur en culture tissulaire a été réalisée en stimulant l'initiateur de réplication de l'ADN (provenant du virus SV 40) et en stimulant la fonction auxiliaire (antigène T) en introduisant le vecteur dans une lignée cellulaire exprimant cet antigène de manière endogène (23 et 29). Le promoteur tardif du virus SV 40 précède le gène de structure de l'interféron et assure la transcription du gène.

Le vecteur utilisé pour l'expression était composé de séquences de pBR 322, qui fournissent un marqueur approprié pour la sélection dans E. coli (résistant à l'ampicilline), ainsi qu'un initiateur de réplication de l'ADN. Ces séquences ont été obtenues à partir du plasmide pML-1 (28) et représentent la région contenant les sites de restriction ECo RI et Bam HI. SV 40 initiateur obtenu dans la composition du fragment PVu II - Hind III taille 342 p. 0, incluant cette région (30 et 31) (les deux extrémités devenues des extrémités de Eco RI). Ces séquences, outre le fait qu’elles contiennent l’initiateur de réplication de l’ADN viral, codent pour le promoteur des unités de transcription précoce et tardive, l’orientation de la région d’initiation de SV-40 était telle que le promoteur de l’unité de transcription tardive était situé à proximité du gène, codage par interféron.

La figure 1 représente une centrifugation à gradient de saccharose de lymphocytes du sang périphérique stimulés par le poly (A) +. Il existe deux maxima d'activité de l'interféron (représentés par des rectangles ombrés) de tailles 12S et 16S. L'emplacement des marqueurs d'ARNr (centrifugés indépendamment) est marqué au-dessus du contour d'absorption.

La figure La figure 2 montre une électrophorèse d'ARN poly (A) + stimulée avec PBL sur un acide-urée-agarose. Un seul pic d'activité est observé, lequel migre avec l'ARN 18S. La position des marqueurs d'ARN ribosomal, qui ont été soumis à une électrophorèse sur la piste adjacente et se manifestent par une coloration au bromure d'éthidium, est marquée au-dessus du contour d'activité.

La figure La figure 3 montre les profils d'hybridation de 96 colonies avec des échantillons d'ADNc marqués au 32P induits et non induits. 96 transformants individuels ont été cultivés sur une plaque de microtitration, la réplique a été placée sur deux membranes de nitrocellulose, puis les filtres ont été hybridés avec des échantillons de 32-ADNc obtenus à partir d'ARNm induit (en haut) ou d'ARNm isolé à partir de cultures de pBL non induites (non induit, en bas). ). Les filtres ont été lavés pour éliminer l'ARN non hybridé, puis exposés à un film pour rayons X. Cette série de filtres représente 86 séries de ce type (8 300 colonies indépendantes). Un exemple de clone induit est marqué H12.

La figure 4 est une carte de restriction de l'insert d'ADNc du clone 69. L'insert d'ADNc est lié aux sites PstI (points aux deux extrémités) et aux queues oligo-dC-dG (lignes droites). Le nombre et la taille des fragments obtenus par scission des nucléases de restriction ont été établis par électrophorèse avec un gel à 6% d'acrylamide. Les positions des parcelles ont été confirmées par séquençage (voir figure 5). La section de codage du plus grand cadre de lecture ouvert est encerclée, la zone ombrée représente 20 résidus de la séquence du peptide signal, tandis que la ligne en pointillé représente la séquence de l'IEN mature (46 acides aminés); 5 "- l'extrémité de l'ARNm est à gauche et l'extrémité 3" est à droite.

La figure 5 montre la séquence nucléotidique de l'insert d'ADNc du plasmide p69. La séquence d'acides aminés «dérivée» du plus long site de lecture ouvert est également présentée. La séquence signal présumée est représentée par les résidus marqués S1 à S20.

La figure 6 est un schéma du plasmide pSV 69 utilisé pour l'expression de IFN-γ dans des cellules de singe.

La figure 7 représente l'hybridation de Southern de 8 ADN génomiques humains digérés par EcoRI différents hybridés avec un fragment DdeI marqué à 32P de 600 pb. de l'insert d'ADNc p69. Deux fragments EcoRI sont clairement hybridés avec une sonde dans chaque échantillon d’ADN.

La figure La figure 8 montre l'hybridation de type Southern de l'ADN génomique humain digéré avec 6 endonucléases de restriction différentes, hybride avec une sonde marquée au 32P de p69.

A. Source d'IFN-ARNm
Les lymphocytes du sang périphérique (PBL) ont été obtenus de donneurs (personnes) par leucophorèse. Ensuite, les PBL ont été purifiés par centrifugation sur gradient dans un mélange de ficoll-héparine, puis ont été cultivés à une concentration de 5 10 6 cellules / ml dans du RPMI 164 avec 1% de L-glutamine, 25 mM d'HEP et une solution de pénicilline-streptomycine à 1% (Gibco Jrand gsland, Ny). ). Ces cellules ont été induites pour produire de l’entérotoxine B stighylococcique IFN-мит mitogène (N µg / ml) et ont été cultivées pendant 34 à 48 heures à 37 ° C dans 5% de CO. La désacétylthymosine - - (0,1 µg / ml) a été ajoutée à la culture de PBL pour augmenter le rendement relatif de l'activité de l'IFN.

B. Isolement de l'ARN messager.

L'ARN total des cultures de PBL a été extrait principalement selon le message de Bergen, S.L. et al. (33). Les cellules ont été isolées par centrifugation, puis remises en suspension dans NaCl 10 mM, TrCS-HCl 10 mM (pH 7,5), MgCl 1,5 mM.2 et complexe ribonucléoside-vanadyle 10 mM. Les cellules ont été lysées par addition de NP-40 (concentration finale 1%) et les noyaux ont été isolés par centrifugation.

Le surnageant contient de l'ARN total, qui est ensuite purifié par extractions multiples avec du phénol et du chloroforme. La phase aqueuse a été portée à 0,2 M de NaCl, puis tout l'ARN a été précipité par addition de deux volumes d'éthanol. L'ARN de cultures non induites (non stimulées) a été isolé de la même manière. La chromatographie sur cellulose oligo-dT (34) a été utilisée pour purifier l'ARNm d'autres espèces d'ARN. Les rendements typiques de 1 à 2 l de PBL en culture étaient de 5 à 10 mg d'ARN total et de 50 à 200 μg de poly (A) + PHK.

C. Fractionnement de l'ARNm par taille.

Deux méthodes ont été utilisées pour fractionner les préparations d'ARNm. Ces méthodes ont été utilisées indépendamment (et non ensemble) et chacune d’elles a conduit à un enrichissement significatif en IFN-ARNm.

Pour le fractionnement de l'ARNm, on a utilisé une centrifugation sur gradient de saccharose en présence de formamide dénaturant. Des gradients de 5 à 25% de saccharose dans du formamide à 70% (32) ont été centrifugés à 154 000 g pendant 19 heures à 20 ° C. Des fractions en série (0,5 ml) ont ensuite été isolées du haut du gradient, précipitées à l'éthanol, puis en aliquotes. a été introduit dans les sociétés Xenopus laevis pour la traduction de l'ARNm (35). Après 24 heures à la température ambiante, l'activité antivirale du milieu d'incubation a été testée à l'aide de la méthode standard d'inhibition de l'effet cytopathique, à l'aide du virus de la stomatite vésiculaire (souche Indiana) ou du virus de la euépholomycardite sur des cellules WISH (amnion humaine) décrites par Stewart (36), à l'exception Les échantillons ont été incubés avec les cellules pendant 24 heures (au lieu de 4) avant d'être infectés par le virus. En conséquence, deux pics d'activité ont été observés pour l'ARN fractionné dans un gradient de saccharose (figure 1). Un pic a été sédimenté avec une taille calculée de 12S et contenait 100 à 400 unités / ml d'activité antivirale (par rapport au standard IFN-γ) par µg d'ARN injecté.

Un autre pic d'activité sédimenté avec une taille de 16S et contenait environ la moitié de l'activité d'un pic sédimenté plus lentement. Chacun de ces pics d'activité semble être associé à l'IFN-α car, pour les mêmes fractions étudiées sur la lignée cellulaire bovine (MDBK), qui ne sont pas protégées par l'IFN-γ humain, aucune activité n'a été observée. L'examen de MDC (5) permet de déterminer facilement l'activité de l'IFN-α et l'activité de l'IFN-α.

Le fractionnement de l'ARNm (260 µg) a également été réalisé par électrophorèse sur gels acide-urée-agarose. Le gel d'agarose visqueux (37 et 38) consistait en 1,75% d'agarose. Citrate de sodium 025 M environ, pH 3,8 et urée 6M. Une électrophorèse a été réalisée pendant 7 heures à 25 mA et à 4 ° C. Ensuite, le gel a été coupé avec une lame de rasoir. Des tranches séparées ont été fondues à 70 ° C, puis extraites deux fois avec du phénol et une fois avec du chloroforme. Les fractions ont été précipitées à l'éthanol, analysées séquentiellement pour déterminer la teneur en ARNm d'IFN-γ en introduisant Xenopus laevis dans des sociétés, puis une analyse antivirale a été réalisée. Pour les échantillons qui ont été fractionnés dans le gel, un seul pic d'activité a été observé (Fig. 2). Ce pic correspond à 18S et a une activité de 600 unités / ml par microgramme d'ARN injecté. Cette activité semble également être spécifique à l'IFN-α, car elle ne protège pas les cellules MDVC. La différence de taille observée sur les gradients de saccharose (12S et 16S) et les gels acide-urée (18S) peut être expliquée par le fait que ces méthodes de fractionnement indépendantes ont été mises en oeuvre dans des conditions inégales de dénaturation complète.

D. Obtenir une bibliothèque de colonies
contenant des séquences d'IFN-.

3 mg d'ARNm de qualité gel ont été utilisés pour préparer un ADNc double brin par des procédures standard (26 et 39); La taille de l'ADNc a été fractionnée sur un gel de Polyacrylamide à 6%. Des fractions de deux tailles ont été électroéluées, 800 - 1500 pb. (138 ng) et> 1500 pb (204 ng). Des portions de 35 ng de chaque taille d'ADNc ont été étendues avec des résidus désoxy C en utilisant une désoxynucléotide transférase terminale (40) et annelées avec 300 ng du plasmide pBK 322 (41), qui a également été réticulé avec des résidus désoxy au site Pst I (40). Chaque mélange renaturé a ensuite été transformé dans la souche 294 de E. coli K12. On a obtenu environ 8 000 transformants avec un ADNc de 800-1500 pb. et 400 transformants d'ADNc> 1500 pb

E. Isolement de la bibliothèque des colonies
ADNc induit.

Les colonies obtenues ont été inoculées séparément dans les puits de plaques de microtitration contenant LB (58) + 5 mc / ml de tétracycline et conservées à -20 ° C après addition de HPMSO à 7%. Deux copies de la bibliothèque de colonies ont été cultivées sur des filtres de nitrocellulose et l'ADN de chaque colonie a été fixé sur le filtre selon la méthode de Gruushtein-Hogness (42).

Des sondes marquées au 32P-ADNc ont été préparées en utilisant un ARNm fractionné sur gel 18S à partir de cultures de PBL induites et non induites. Oligo d T 12-18 a été utilisé comme apprêt; utilisé les conditions de réaction décrites précédemment (I). Filtres contenant 8 000 transformants avec une taille d'ADNc de 600-1500 pb. et 400 transformants avec une taille d'ADNc de plus de 1500 pb. hybride avec 20 10 6-ADNc induite par CPM. Un jeu de filtres en double a été hybridé avec 20 32 ADNc de 32 P non induit. L'hybridation a été réalisée pendant 16 heures en utilisant les conditions décrites par Fritsch et al (43). Les filtres ont été soigneusement lavés (43), puis exposés à un film radiographique Kodakov XR-5 à l'aide de Du Pont Lighitning-Plus. intensification des écrans pendant 16 à 48 heures: comparaison du modèle d'hybridation de chaque colonie avec deux échantillons.

Environ 40% des colonies étaient clairement hybridées avec les deux sondes, tandis qu'environ 50% des colonies ne s'hybridaient pas avec une seule sonde (voir la figure 3). 124 colonies ont été hybridées de manière marquée avec une sonde individuelle, mais de manière indétectable ou très faible avec une sonde non induite. Ces colonies ont été individuellement inoculées dans les puits de plaques de microtitration, cultivées et transférées sur des filtres de nitrocellulose, puis hybridées avec les deux mêmes échantillons que ceux décrits ci-dessus. L'ADN plasmidique isolé de chacune de ces colonies par une méthode rapide (44) a également été associé à des filtres de nitrocellulose et hybridé (45) à des sondes stimulées. Les ADN de 22 colonies, hybridés uniquement avec des sondes d'induction, ont été appelés colonies "induites".

F. Caractéristiques des colonies induites.

L'ADN plasmidique a été obtenu à partir de 5 colonies induites (46) et utilisé pour caractériser l'insert d'ADNc. Le marquage de restriction de cinq plasmides induits (p67, p68, p69, p70 et p71) a montré que quatre d'entre eux ont des cartes de restriction similaires. Ces quatre plasmides (p67, p69, p71 et p72) ont chacun quatre tracés Dde, deux tracés Hinf 1 et un tracé Rsa 1 dans l'insert d'ADNc. Le cinquième plasmide (p68) contient le fragment Dde 1 habituel et, apparemment, est un clone d'ADNc court appartenant aux quatre autres. L'homologie, supposée sur la base d'une cartographie utilisant des nucléases de restriction, a été confirmée par hybridation. Préparé un échantillon d'ADN marqué au 32P (47) à partir d'un fragment DdeI de 600 pb. plasmides p67 et utilisés pour l'hybridation (42) avec le reste des colonies induites. Les cinq colonies de restriction de la nucléase colonisées ont toutes été hybridées avec cette sonde, ainsi que 17 autres des 124 colonies sélectionnées au cours du dépistage. La longueur de l'insert d'ADNc dans chacun de ces plasmides à hybridation croisée a été déterminée par digestion de PstI et en utilisant une électrophorèse sur gel. Le clone avec le plus long insert d'ADNc semble être le clone 69 avec une taille d'insert de 1200-1400 pb. Cet ADN a été utilisé dans toutes les expériences ultérieures, sa carte de restriction est montrée à la Fig. 4

L'insert d'ADNc dans p69, comme indiqué, est un IFN-ADNc obtenu à partir de trois systèmes d'expression indépendants pour des produits présentant une activité antivirale, comme décrit plus en détail dans infra.

G. Analyse de l'insertion séquentielle d'ADNc p69.

La séquence nucléotidique complète de l'insert d'ADNc du plasmide p69 a été déterminée par la méthode de terminaison de chaîne didésoxucléotidique (48) après sous-clonage des fragments dans le vecteur M13 m 7 (49) et par la méthode chimique de Maxam et Gilbert (52). Le cadre de lecture ouvert le plus long code la protéine de 166 acides aminés présentée à la Fig. 5. Le premier résidu code pour le premier codon méthionine inclus dans l'extrémité 5 "de l'ADNc. Les 20 premiers résidus à l'extrémité amino-terminale servent probablement de séquence signal pour la sécrétion des 146 acides aminés restants. Cette séquence signal présumée avec d'autres séquences signal connues est combinée, par exemple, par la taille et l'hydrophobicité. En outre, les quatre acides aminés présents dans la séquence pouvant être clivée (ser-leu-glu-cys) étaient identiques aux quatre résidus trouvés au point de clivage de plusieurs leucocytes. s interférons (LeIF B, C, D, F et H (2)). La séquence d'acides aminés mature codé de 146 acides aminés (ci-après dénommée "l'interféron immun humain recombinant") a un poids moléculaire de 17.140.

Il existe deux positions potentielles de glycosylation (50) dans la séquence protéique codée, dans les acides aminés de 28 à 30 (asn-gly-thr) et les acides aminés de 100 à 102 (asn-tyr-ser). L'existence de ces dispositions est cohérente avec la glycosylation observée de l'IFN- humain (6 et 51). De plus, les deux seuls résidus de cystéine (positions 1 et 3) sont trop proches du point de vue stérique pour former un pont disulfure, ce qui concorde avec la stabilité observée de l'IFN-γ en présence d'agents réducteurs tels que l'IFN-γ - mercaptoéthanol (51). La séquence d’acides aminés mature dérivée, en général, est la principale, avec un total de 30 résidus lysine, arginique et histidine et un total de 19 résidus acides aspartiques et glutamiques.

La structure de l'ARNm d'IFN-y établie à partir de la séquence d'ADN du plasmide p69 diffère nettement de l'ARNm d'IFN- (1,2) ou d'IFN- (5). Ainsi, la région codante de l'IFN- est plus courte, bien que les 5 régions "non traduites et 3" non traduites soient beaucoup plus longues que dans l'IFN-FN- et l'IFN-.

H. La structure de la séquence codante du gène IFN-.

La structure du gène codant pour IFN-γ a été analysée par hybridation. Dans cette procédure (54), 5 µg d’ADN humain de haut poids moléculaire (obtenu par le procédé 55) sont complètement digérés avec diverses endonucléases de restriction, l’électrophorèse est effectuée sur un gel à 1,0% d’agarose (56) et transférée sur un filtre de nitrocellulose (54). Un échantillon d'ADN marqué au 32P est préparé (47) à partir d'un fragment DdeI de 600 pb. Inserts d'ADNc p69 et hybrides (43) avec une coloration d'ADN sur le filtre. 10 7 impulsions par minute de l'échantillon ont été hybridées pendant 16 h, puis lavées comme décrit (43). Huit échantillons d'ADN génomique provenant de différents donneurs (humains) ont été digérés avec EcoRI et hybrides avec une sonde marquée au p69 32P. Comme le montre la Fig. 7, il existe deux signaux d'hybridation distincts d'une taille de 8,8 m. et 2,0 pm, qui est établi en comparant la mobilité avec l'ADN digéré par Hind III. Cela pourrait être le résultat de la présence de deux gènes IFN-ген ou d'un gène digéré au site EcoRI. Étant donné que l'ADNc de p69 ne contient pas de sites EcoRI, pour expliquer sa présence dans le gène, une séquence intermédiaire (intron) avec la partie interne de EcoRI devra être admise. Afin de faire la distinction entre ces deux possibilités, une autre hybridation de Southern a été réalisée avec la même sonde et cinq autres digestions par endonucléase d'un ADN humain (figure 8). Deux fragments d'ADN hybridés ont été observés pour d'autres digestions d'endonucléases, PVUII - 6,7 kb. et 4,0 et Hinc II (2,5 kb et 2,2 kb). Cependant, les trois images restantes de la digestion par endonucléase ne donnent qu'un seul fragment d'ADN hybride: Hind III (9,0 kb), Bdl II (11,5 kb) et BamHI (9,5 tonnes).. o.) Deux gènes IFN doivent être liés par une distance inhabituellement courte (moins de 9,0 kvr) pour être dans le même fragment Hihd III. Ce résultat suggère qu'un seul gène IFN homologue (contrairement à de nombreux gènes liés à l'IFN) est présent dans l'ADN génomique humain et que ce gène est séparé par un ou plusieurs introns contenant les sites Eco RI, PVU II et Hind II. Cette hypothèse a été confirmée par l'hybridation d'un fragment (47) marqué au 32P obtenu à partir de la région non traduite 3 "de l'ADNc de p69 (fragment de 130 pb. Dde I de 860 à 990 sur la figure 5) avec digestion par EcoRI du gène génomique humain. ADN. Seuls 2,0 kb du fragment EcoRI s'hybrident avec cette sonde, indiquant que ce fragment contient 3 "séquences non traduites, alors que 3,8 kb. Le fragment EcoRI contient des séquences de 5 ". La structure du gène IFN- (un gène avec au moins un intron) diffère significativement de IFN- (plusieurs gènes (2) sans introns (56)) ou IFN- (un gène sans introns (57 )).

J. Construction du vecteur de culture cellulaire pSV 69.

Un fragment de 342 paires de bases Hind III-PVU III, y compris l'initiateur SV 40, a été transformé en un fragment lié au site de restriction Eco R I. Le site Hind III a été converti en ajoutant un oligomère synthétique (AGCTGAATTC 5d) et le site PVU II a été converti par piqûre à l'extrémité émoussée en un site Eco RI, en le complétant avec la Polymérase I (fragment de Klenow). Le fragment EcoRI résultant a été inséré dans le site pML EcoRI (28). Le plasmide avec le promoteur tardif SV40, orienté à l'opposé du gène amp R, a ensuite été modifié en éliminant le site Eco R I le plus proche du gène amp R pML-1 (27).

Un fragment de 1023 paires de bases HpaI - BglII de l'ADN cloné du VHB (60) a été isolé et le site Web HpaI du virus de l'hépatite B (VHB) a été converti en un site Eco RI avec un oligomère synthétique (5 "dGGGAATTCGC). Ce fragment Eco RI-Bgl II a été directement cloné. dans Eco RI - BamH I, les sites du plasmide décrits précédemment et portant l'initiateur SV 40.

Le site Eco R I restant a été inséré avec une séquence codant IFN sur le fragment Pst I de p69 de 1250 pb. après conversion des extrémités PstI en extrémités Eco R I. Ces clones ont été isolés dans lesquels le promoteur tardif SV 40 a précédé le gène IFN. Le plasmide résultant pSV 69 (figure 6) a ensuite été introduit dans des cellules de cultures tissulaires (29), en particulier des cellules COS-7, en utilisant le procédé au DEAE-dextrane (61), modifié de sorte qu'une transfection en présence de DEAE-dextrane soit réalisée pour 8 h Le milieu cellulaire a été changé tous les 2-3 jours. Chaque jour, 200 µl ont été recueillis pour le dosage biologique de l'interféron. Les rendements typiques étaient de 50-100 U / ml dans les échantillons analysés trois ou quatre jours après la transfection.

L'analyse a montré que le produit d'expression ne possède pas la partie cys-tyr-cys-N-terminale de l'immunointerféron humain recombinant (cf. Fig. 5), ce qui indique que le phénomène de clivage du peptide signal passe par la liaison cys-GLN (acides aminés 3 et 4 sur Fig. 5) et que le polypeptide mature consiste en réalité en 143 acides aminés (interféron gez-cys-Tyr-cys-immunitaire).

J. Purification partielle de l'interféron humain recombinant cis-cys-Tyr-cys humain.

Pour obtenir de grandes quantités d'interféron IFN-γ humain sécrété par des cellules de singe, des monocouches fraîches de cellules COS-7 dans dix plaques de 10 cm ont été transfectées à un total de 30 μg de pDL 1 3 dans 110 ml de DEAE-dextran (200 μg / ml, DEAE dextran 500 000 MW; 0, Tris 05 M, pH 7,5 dans le DMEM). Après 16 heures à 37 ° C, les plaques ont été lavées deux fois avec du DMEM. On a ensuite ajouté à chaque plaque 15 ml de DMEM frais supplémenté avec 10% de f.b.s., 2 mM de glutamine, 50 µg / ml de pénicilline G et 50 mg / ml de streptomycine. Le milieu a été remplacé par du DMEM sans sérum. Un milieu frais, sans sérum, a ensuite été ajouté quotidiennement. Le milieu récolté a été stocké à 4 ° C jusqu'à son utilisation pour l'analyse ou sa liaison au CPG. Il a été constaté que les fractions recueillies 3 et 4 jours après la transfection conservaient presque toute l'activité.

On a ajouté 0,5 g de surnageant de cellules à 0,5 g de CPG (taille du verre poreux contrôlé Electonucleonics CPG 350 dans des sachets 120/200), et le mélange a été agité pendant 3 heures à 4 ° C. Après un bref centrage dans une centrifugeuse à dessus beuch, les billes sédimentées ont été remplies. colonne et soigneusement lavée avec du tampon NaPO 20 mM4, NaCl 1 M, mercaptoéthanol à 0,1%, pH 7,2. L'activité a ensuite été éluée avec le même tampon contenant 30% d'éthylène glycol, puis par élution avec le tampon ci-dessus contenant 50% d'éthylène glycol. Presque toutes les activités sont associées aux GPC. On a trouvé 75% de l'activité éluée dans les fractions éluées avec 30% d'éthylène glycol. Ces fractions ont été recueillies et diluées avec du NaPO 20 mM.4 NaCl 1 M, pH 7,2 jusqu'à la concentration finale d'éthylène glycol à 10% et directement injectée dans une colonne Con A Sepharose de 10 ml (Pharmacia). Après un lavage approfondi avec NaPO 20 mM4 - NaCl 1 M, pH 7,2, activité éluée avec NaPO 20 mM4 - NaCl 1 M - 0,2 M-méthyl-D-mannoside. Une quantité significative d'activité (55%) n'est pas associée à cette lectine, 45% de l'activité est élué avec du méthyl-D-mannoside.

K. Compositions pharmaceutiques.

Les composés de la présente invention peuvent être incorporés conformément à des procédés connus dans des compositions pharmaceutiquement acceptables dans lesquelles un interféron immun humain est combiné dans un mélange avec un support pharmaceutiquement acceptable. Des supports appropriés et leurs compositions sont décrits dans Pharmaceutical Science de Pemington, qui est incorporé à titre de référence. De telles compositions doivent contenir une quantité efficace d’une protéine interféron conformément à la présente invention ainsi qu’une quantité appropriée d’excipient pour produire une composition pharmaceutiquement acceptable appropriée pour une administration efficace à un patient.

L'interféron humain immunitaire de la présente invention peut être administré par voie parentérale à un patient pour lequel un traitement antitumoral ou antiviral est nécessaire, ainsi qu'à ceux qui sont dans un état immunodéprimé. Les doses et la fréquence d'administration peuvent être similaires à celles couramment utilisées dans les études cliniques sur d'autres interférons humains; c'est-à-dire environ (1-10) 10 6 unités par jour et, dans le cas de matières d'une pureté supérieure à 1%, apparemment jusqu'à 50 10 6 unités. tous les jours Les doses d'IFN-a peuvent être considérablement augmentées pour obtenir un effet plus important, ce qui est associé à l'absence pratique de protéines humaines autres que l'IFN-,, qui, lorsqu'elles sont utilisées avec des matériaux dérivés d'êtres humains, peuvent avoir un effet opposé.

A titre d'exemple d'un dosage approprié pour un IFN-γ sensiblement homogène utilisé ici sous forme parentérale, 3 mg peuvent être indiqués. L'activité spécifique de l'IFN, par exemple 2 10 8 u / mg, peut être dissoute dans 25 ml de 5 n. sérum-albumine (humaine) USP, passer la solution à travers un filtre bactériologique et filtrer la solution divisée de manière aseptique en 100 ampoules, chacune contenant 6 10 6 unités. interféron pur adapté à une administration parentérale. Ampoules de préférence conservées au froid (-20 ° C) avant utilisation.

1. Caractérisation de l'activité antivirale.

Pour neutraliser les anticorps, les échantillons ont été dilués, si nécessaire, à une concentration de 500-1000 unités / ml en ajoutant du PBS-BSA. Des volumes égaux d'échantillons ont été incubés pendant 2 à 12 heures à 4 ° C avec une série de dilutions de leucocytes, de fibroblastes ou d'antisérum d'interféron immun anti-humain de lapin. Anti-IFN- et reçu de l'Institut national des maladies allergiques et infectieuses. L'anti-IFN-a a été préparé en utilisant un IFN-γ esthétique (pureté de 5 à 20%) purifié à partir de lymphocytes stimulés par le sang périphérique. Les échantillons ont été centrifugés pendant 3 min à 1200 xg pendant 3 min avant le test. Pour vérifier la stabilité du pH 2, les échantillons ont été ajustés à pH 2 en ajoutant 1N. HCl, incubé pendant 2 à 12 heures à 4 ° C et neutralisé par addition de 1 n. NaOH avant l'étude. Pour tester la sensibilité du sulfate de sodium dodécyle (SDS), les échantillons ont été incubés avec un volume égal de SDS à 0,2% pendant 2-12 heures à 4 ° C immédiatement avant l'analyse.

Les caractéristiques de l'IFN obtenu dans les cellules COS - 7 sont données dans le tableau.
Ce tableau montre le comportement caractéristique des normes IFN-,, - après divers traitements. L'activité d'interféron obtenue avec COS-7 / psv 69 est sensible à l'acide, sensible au SDS et est neutralisée par un antisérum d'interféron immun. Il n'est pas neutralisé par des anticorps anti-IFN- ou. Ces données confirment que les produits obtenus dans ce système sont des immunointerférons et que, pour l'insert d'ADN du plasmide p69, code pour IFN-γ.

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FORMULE DE L'INVENTION

Procédé d'obtention d'un interféron immun humain, impliquant la culture d'une lignée cellulaire animale, l'isolement et la purification du produit cible, caractérisé en ce que la lignée cellulaire COS-7 transformée avec l'ADN du plasmide recombinant pSVj69 est cultivée et que l'on isole l'interféron des-Cys-Tyr-Cys.